近年來,隨著免疫學的不斷發展以及ELISA試劑盒檢測技術的應用,對雙歧桿菌的鑒定和檢測已從傳統的平板計數方法發展到應用以抗原抗體反應為基礎的各種酶免疫檢測方法。在所有以抗原抗體反應為基礎的檢測方法中,酶聯免疫吸附法（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）是目前發展zui為迅速并且較為完善的檢測方法。
ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記,根據酶反應底物顯色的深淺進行定性或定量分析。由于利用了酶的率催化反應,間接放大了免疫反應的結果,使測定具有*的靈敏度。而且,ELISA檢測是在微量板中進行的,可以對大量樣品同時進行檢測,節省了時間。ELISA法中的雙抗體夾心方法是常用來檢測抗原的方法。目前所報道的相關研究中,都未能對利用雙抗夾心ELISA方法檢測雙歧桿菌的反應條件進行建立并且沒有對雙歧桿菌進行定量檢測的研究。ELISA方法克服了傳統平板計數法的繁瑣及分子生物學檢測方法的費用昂貴等缺點,如能開發出其檢測雙歧桿菌的試劑盒將對實際應用將具有重要意義。
故此,建立本課題展開這方面的研究。 本課題中,自制并獲得了價免疫血清;建立并優化了雙抗夾心ELISA檢測雙歧桿菌的方法;用建立起的ELISA法組裝試劑盒,對試劑盒進行方法學評價,非雙歧桿菌屬微生物對本試劑盒的檢測結果無影響,重復性良好,對雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL（g）;檢測時間為4h;用此試劑盒檢測市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進行檢測時,與傳統菌落計數方法相比,兩種檢測方法檢測結果差異不顯著（p0.05）;用此試劑盒對自制含雙歧桿菌的乳粉產品（1）進行檢測時,與傳統菌落計數方法相比,兩種檢測方法檢測結果差異顯著（p0.05）。
ELISA試劑盒具體研究結果如下:
1.免疫血清的制備 制備出的兔抗長雙歧桿菌免疫血清效價可達1:20480;鼠抗長雙歧桿菌免疫血清效價達1:10240,均具有較高的效價。
2.雙抗夾心ELISA方法檢測雙歧桿菌zui適反應條件的建立 通過對雙抗夾心ELISA檢測方法中各反應條件進行摸索和比較,確定*反應條件為:*包被抗體和二抗反應濃度分別為1:160和1:5120;選用NBS和1%BSA-PBS分別作為包被緩沖液和封閉緩沖液;封閉30min;酶標抗體作1:2000的稀釋之后作用90min;zui后底物反應時間為20min;并且繪制了此方法檢測雙歧桿菌的標準曲線,得出了標準曲線方程:y=0.4461x-2.1503,相關系數為R2=0.9881。
3. ELISA試劑盒的組裝 試劑盒主要組分有:兔抗長雙歧桿菌免疫血清包被并封閉的8×12孔酶標板;工作濃度鼠抗長雙歧桿菌免疫血清;工作濃度酶標抗體;長雙歧桿菌標準品;底物溶液;終止液;濃縮洗滌液;操作方法及說明。
4.試劑盒的方法學評價 對所組建的雙抗夾心ELISA檢測雙歧桿菌的試劑盒進行了方法學評價,包括:特異性、重復性、靈敏度。對分別含有4種不同雙歧桿菌和七種不含雙歧桿菌的樣品進行檢測,非雙歧桿菌屬微生物對檢測結果沒有影響,說明此方法具有較強的特異性;用五種不同樣品對板間及板內分別做了重復性實驗,僅有很好的幾分樣品變異系數超過10%,說明此試劑盒具有良好的重復性;對雙歧桿菌的zui低檢出限為106cfu/mL;
5.試劑盒的保存期實驗 通過對包被酶標板的保質期進行測定,實驗證明,此試劑盒能在4℃的條件下保存一年以上; 6.試劑盒在雙歧桿菌檢測中的應用 采用所組建的雙歧桿菌雙抗夾心ELISA試劑盒對市售雙歧桿菌的酸奶、奶粉及自制雙歧桿菌乳粉進行檢測與平板計數法相比。用此試劑盒檢測市售酸奶（1）、市售乳粉和自制乳粉（2）進行檢測時,與傳統菌落計數方法相比,兩種檢測方法檢測結果差異不顯著（p0.05）;用此試劑盒對自制含雙歧桿菌的乳粉產品（1）進行檢測時,與傳統菌落計數方法相比,兩種ELISA試劑盒檢測方法檢測結果差異顯著（p0.05）。
