伊人国产在线视频-伊人干-伊人丁香狠狠色综合久久-伊人丁香-伊人第一路线-伊人导航

定義　　質(zhì)粒（plasmid）是細(xì)菌擬核裸露DNA外的遺傳物質(zhì)，為雙股閉合環(huán)形的DNA,存在于細(xì)胞質(zhì)中，質(zhì)粒編碼非細(xì)菌生命所必須的某些生物學(xué)性狀，如性菌毛、細(xì)菌素、毒素和耐藥性等。質(zhì)粒具有可自主復(fù)制、傳給子代、也可丟失及在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移等特性，與細(xì)菌的遺傳變異有關(guān)。

特征

　　是真核細(xì)胞細(xì)胞核外或原核生物擬核區(qū)外能夠進(jìn)行自主復(fù)制的遺傳單位，包括真核生物的細(xì)胞器（主要指線粒體和葉綠體）中和細(xì)菌細(xì)胞擬核區(qū)以外的環(huán)狀脫氧核糖核酸（DNA）分子。現(xiàn)在習(xí)慣上用來專指細(xì)菌（大腸桿菌）、酵母菌和放線菌等生物中細(xì)胞核或擬核中的DNA以外的DNA分子。在基因工程中常被用做基因的載體（Vector）。許多細(xì)菌除了擬核中的DNA外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是（plasmid）（補(bǔ)充：部分為RNA）。上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些稱為附加體（episome），這類能夠整合進(jìn)真菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。在宿主細(xì)胞體內(nèi)外都可復(fù)制！

　　目前，已發(fā)現(xiàn)有的細(xì)菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細(xì)菌都是閉合環(huán)狀DNA分子（簡稱cccDNA）。細(xì)菌的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細(xì)菌染色體的0.5%～3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把分成大小兩類：較大一類的相對分子質(zhì)量是40×106以上，較小一類的相對分子質(zhì)量是10×106以下（少數(shù)的相對分子質(zhì)量介于兩者之間）。每個細(xì)胞中的數(shù)主要決定于本身的復(fù)制特性。按照復(fù)制性質(zhì)，可以把分為兩類：一類是嚴(yán)緊型，當(dāng)細(xì)胞染色體復(fù)制一次時，也復(fù)制一次，每個細(xì)胞內(nèi)只有1～2個；另一類是松弛型，當(dāng)染色體復(fù)制停止后仍然能繼續(xù)復(fù)制，每一個細(xì)胞內(nèi)一般有20個左右。這些的復(fù)制是在寄主細(xì)胞的松弛控制之下的，每個細(xì)胞中含有10-200份拷貝，如果用一定的藥物處理抑制寄主蛋白質(zhì)的合成還會使拷貝數(shù)增至幾千份。如較早的pBR322即屬于松弛型，要經(jīng)過氯霉素處理才能達(dá)到更高拷貝數(shù)。一般分子量較大的屬嚴(yán)緊型。分子量較小的屬松弛型。的復(fù)制有時和它們的宿主細(xì)胞有關(guān)，某些在大腸桿菌內(nèi)的復(fù)制屬嚴(yán)緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。

培養(yǎng)

　　在基因工程中，常用人工構(gòu)建的作為載體。人工構(gòu)建的可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點(diǎn)、抗生素耐藥性等。常用的人工運(yùn)載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因（Tcr）和抗氨芐青霉素基因（Apr），并含有5種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)。如果將DNA片段插入EcoRI切點(diǎn)，不會影響兩個抗生素基因的表達(dá)。但是如果將DNA片段插入到Hind III、Bam H I 或 Sal I切點(diǎn)，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細(xì)菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。沒有DNA插入片段的pBR322會使宿主細(xì)菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322的細(xì)菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點(diǎn)。運(yùn)載體的zui大插入片段約為10 kb（kb表示為千堿基對）。

　　1973年，科學(xué)家將作為基因的載體使用，為基因工程的誕生奠定了基礎(chǔ)。

　　zui常用的是大腸桿菌的。這種常含有抗生素抗性基因，例如，卡那霉素抗性基因。

　　pBR322

　　pBR322DNA分子的長度為4363bp，此載體中有兩個標(biāo)記基因，一個是氨芐青霉素抗性基因（Apr），另一個是四環(huán)素抗性基因（Tetr）。現(xiàn)在已知pBR322DNA分子共有24種核酸內(nèi)切限制酶的單一識別位點(diǎn)。其中7種限制酶（從12：00位置按順時針方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII和NruI的識別位點(diǎn)位于四環(huán)素抗性基因內(nèi)部，另

　　外有2 種限制酶即ClaI和HindIII的識別位點(diǎn)是存在于這個基因的啟動區(qū)內(nèi)，在這9個限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會導(dǎo)致tetr的失活。3種限制酶即ScaI、PvuI和PstI的識別位點(diǎn)位于氨芐青霉素抗性基因內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會導(dǎo)致ampr基因的失活。由pBR322載體的結(jié)構(gòu)可知其具有如下優(yōu)點(diǎn)：（1）具有較小的分子量。經(jīng)驗(yàn)表明，為了避免在DNA的純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體的分子大小不要超過10Kb。pBR322這種小分子量的特點(diǎn)，不僅易于自身DNA的純化，而且可容納較大的外源DNA片段；（2）具有兩種抗菌素抗性基因可供作轉(zhuǎn)化子的選擇記號，能指示載體或重組DNA分子是否進(jìn)入宿主細(xì)胞以及外源DNA分子是否插入載體分子形成了重組子。標(biāo)記基因往往可以賦予宿主細(xì)胞一種新的表型，這種轉(zhuǎn)化細(xì)胞可明顯地區(qū)別于非轉(zhuǎn)化細(xì)胞。當(dāng)我們把一個DNA片段插入到某一個標(biāo)記基因內(nèi)時，該基因就失去了相應(yīng)的功能。當(dāng)把這種重組DNA分子轉(zhuǎn)到宿主細(xì)胞后，該基因原來賦予的表型也就消失了。要是仍保留了原來表型的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含有的DNA分子一定不是重組子。很顯然，既要指示外源DNA是否進(jìn)入了宿主細(xì)胞，又要指示載體DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么這種載體必須至少具有兩個標(biāo)記基因。另外，pBR322載體還具較高的拷貝數(shù)，而且經(jīng)過氯霉素?cái)U(kuò)增之后，每個細(xì)胞中可積累1000~3000個拷貝，這就為重組體DNA的制備提供了極大的方便。

pBR322載體的構(gòu)建

　　pBR322載體的構(gòu)建過程可簡單地概括如下：

　　1、由于pBR322的親本之一是pMB1，故首先以pMB1為基礎(chǔ)，引入Rldrd19的Tn3易位子，得到13.3kb的pMB3；

　　2、pMB3的分子量顯然使得它不適合作為載體，所以要通過在EcoRI活性條件下的消化讓它大部分的無用片段失去，留下來的小片段的DNA的黏性末端連接起來后就形成了pMB8（2.6kb）；

　　3、此時，另外一種pSC101在EcoRI活性條件下消化產(chǎn)生了含有tetr抗性的DNA片斷，這個片斷和pMB8整合在一起就形成了pMB9（5.3kb）。此時pMB9為ampstetr表型；

　　4、pMB9已經(jīng)初步具備載體的功能，為了讓它更加完善，我們要讓它具備amprtetr性能，即在pMB9上引入pSF2124的Tn3易位子，但Tn3可以來也可以走，為了留住它，我們切去了Tn3中表達(dá)轉(zhuǎn)位酶的基因，形成了pBR313。

　　此后我們兵分兩路：一路把pBR313的PstI位點(diǎn)除去，使之成為ampstetr表型的pBR318；

　　5、；另一路把pBR313的EcoRII的位點(diǎn)切除，使之成為amprtets表形的pBR320。

　　由此我們的到了兩種功能互補(bǔ)的，這樣我們只要將他們雜交就可以得到一種接近的載體了，這就是pBR322 。

pBR322的應(yīng)用

　　了解了pBR322的結(jié)構(gòu)和它的構(gòu)建過程之后，我們來看pBR322在基因工程中的應(yīng)用。

　　pBR322作為一種常用的基因克隆載體，在實(shí)際應(yīng)用中有著非常重要的地位，其中一個突出的例子就是應(yīng)用pBR322 作為克隆載體對水稻的葉綠體光誘導(dǎo)基因psbA 進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

　　將水稻葉綠體的DNA，用EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶消化之后，放入含有溴化乙錠的低熔點(diǎn)（LMP）的1%瓊脂糖凝膠中作電泳分離。從LMP中分離出分子大小為1.8～2.5kb之間的DNA片段，再與同樣經(jīng)過了EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割并用堿性磷酸酶作了脫磷酸處理的pBR322連接。然后，將混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌5346菌株，培養(yǎng)在氨芐青霉素選擇平板上，形成Ampr轉(zhuǎn)化子菌落群體。這樣就構(gòu)成了由EcoRI核酸限制性內(nèi)切酶切割的水稻葉綠體DNA基因組庫。用Ampr轉(zhuǎn)化子菌落與32P放射性標(biāo)記的玉米psbA DNA 探針作菌落雜交，可以分離出其中的陽性克隆體。從這些陽性克隆體中分離出來的重組體DNA，經(jīng)過進(jìn)一步的分析，就能測出水稻葉綠體基因psbA的序列。

　　利用pBR322作為載體重組人體的抑生長激素也是一個經(jīng)常提到的應(yīng)用例子。其過程和水稻葉綠體基因重組大同小異，只是除了在載體上插入抑生長激素基因外，還將含有lac操縱子起始部分的片段（包括啟動子、操縱區(qū)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和β－半乳糖苷酶的主要部分）插在抑生長激素基因的旁邊。由于有了lac操縱子的控制，重組基因產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)就變得比較容易了。