質(zhì)粒DNA實(shí)驗(yàn)步驟：
一、搖菌培養(yǎng)
1. 將鑒定測序正確的克隆菌液涂在LB固體平板。
2. 置于37℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)12-17h，待長出菌落。
3. 滅菌15ml離心管內(nèi)加入5ml含抗生素的LB液體培養(yǎng)基，編號標(biāo)記。
4. 挑取單克隆菌團(tuán)放置液體培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)基放置1個(gè)菌落。
5. 37℃，180rpm，振蕩培養(yǎng)過夜。
二、質(zhì)粒DNA的純化
1. 將之前提取好的質(zhì)粒放入1.5ml離心管中，加入1/10體積的3mol/L 無菌乙酸鈉溶液。
2. 加入2倍體積的無水乙醇，放置于-20℃沉淀4-6h或過夜。
3. 4℃，高速離心機(jī)14000rpm，離心20min。
4. 棄去上清，70%乙醇洗2次。
5. 空氣干燥，可置超凈工作臺(tái)干燥。
6. 加200ul無菌水溶液干燥后所得沉淀，即為質(zhì)粒溶液。
7. 紫外分光光度計(jì)測量質(zhì)粒濃度和產(chǎn)量。測量OD260和OD280的值：質(zhì)粒DNA濃度=OD260×50×稀釋倍數(shù)(μg/mL)。
三、質(zhì)粒DNA提取常見問題
1. 時(shí)間控制問題裂解時(shí)間太長，加入溶液P2后裂解時(shí)間不應(yīng)超過5 分鐘；吸附時(shí)間不夠；溶解時(shí)間不夠都會(huì)導(dǎo)致質(zhì)粒DNA提取實(shí)驗(yàn)失敗。
2. 大腸桿菌老化建議涂布平板培養(yǎng)后，重新挑選新菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)。
3. 質(zhì)粒拷貝數(shù)低由于使用低拷貝數(shù)載體引起的質(zhì)粒DNA 提取量低，可更換具體相同功能的高拷貝數(shù)載體。
4. 溶液使用不當(dāng)溶液P2、P3 在溫度較低時(shí)可能出現(xiàn)渾濁，應(yīng)置于37℃保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，才能使用。
5. 吸附柱過載不同產(chǎn)品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質(zhì)粒量很大，請分多次提取。若用富集培養(yǎng)基，例如TB 或者 ×YT 菌液體積必須減少；若質(zhì)粒或宿主菌是非常高的拷貝數(shù)或生長率，則需調(diào)整LB 培養(yǎng)液體積。
6. 質(zhì)粒未全部溶解洗脫溶解質(zhì)粒時(shí)，可適當(dāng)加溫或延長溶解時(shí)間。
7. 乙醇?xì)埩羝匆合礈旌髴?yīng)離心盡量去除殘留液體，樹脂型試劑盒漂洗后應(yīng)晾干樹脂，再加入洗脫緩沖液。
8. 洗脫液加入位置不正確洗脫液應(yīng)加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會(huì)覆蓋硅膠膜的表面達(dá)到洗脫效率。
9. 洗脫液不合適DNA 只在低鹽溶液中才能被洗脫。洗脫效率取決于pH 值。洗脫效率在pH7.0～ 8.5 間。當(dāng)用水洗脫時(shí)確保其 pH 值在此范圍內(nèi)，如果pH 過低可能性導(dǎo)致洗脫量低。洗脫時(shí)將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加暖至 60 ℃后使用有利于提高洗脫效率。
10. 洗脫體積太小洗脫體積對來回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產(chǎn)品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
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