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上海通蔚生物幾招搞定細胞株純化方法
更新時間:2022-07-12   點擊次數:1637次

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細胞株分離的方法有多種,常用的是機械解離細胞法、酶學解離細胞法以及螯合劑解離細胞法,下面我們就介紹酶解聚方法獲得純化的細胞株。

(1)純化法

在去除不需要的組織后,使用無菌的解剖刀和剪子把剩余的組織切成3~4 mm小片,通過懸浮在無鈣鎂的中清洗組織碎片。讓組織碎片沉淀,去除上清液。重復清洗2到3次。

將盛有組織碎片的容器置于冰上,去除殘留的上清液。加入0.25%溶解在無鈣鎂的(100 mg組織加入1ml )。

在4℃孵育6到18小時,使幾乎沒有活性的酶盡可能滲透進去。

移棄組織碎片中的,在37℃孵育包含殘留的組織碎片20到30分鐘。

在組織碎片加入熱的*培養基,用移液管輕輕地分散組織。如果使用無血清培養基,要加入大豆抑制劑。

通過無菌不銹鋼絲網(100~200 mm)過濾,分散所有剩余組織。計數和接種細胞,進行培養。

(2)膠原酶純化法

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用Hanks'平衡液(HBSS)清洗組織碎片幾次。

加入膠原酶(50~200單位/ml,溶解在HBSS中)。

在37℃孵育4到18小時。加入3mM CaCl2增加解離效率。

通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的膠原酶。

通過離心在HBSS中清洗懸液幾次。

再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。

(3)Dispase純化法

用無菌解剖刀和剪子把剩余組織切成3~4 mm小片,用不含鈣鎂的清洗組織碎片幾次。

加入Dispase(0.6~2.4單位/ml 溶解在無鈣鎂的

在37℃孵育20分鐘到幾個小時。

通過無菌不銹鋼絲網或尼龍網過濾細胞懸液,以分離分散細胞、組織碎片和較大的碎片。如果需要進一步的解聚,在碎片中加入新鮮的Dispase。

通過離心在中清洗懸液幾次。

再一次在培養基中懸浮細胞,計數和接種細胞,進行培養。

分離細胞后,首ci傳代需要注意的問題:

傳代培養時先觀察細胞的活性。

細胞的活率應該超過90%,密度控制在80%左右

對于無血清培養基,需要降低使用量。

(1) 移棄使用過的細胞培養基。

(2)使用不包含有鈣鎂的或EDTA清洗細胞。在培養瓶背著細胞的一面加入清洗溶液,通過轉動培養瓶1到2分鐘清洗細胞層,然后去除清洗液。

(3)加入消化,消化細胞與細胞,操作手法,試劑的效價有密切的關系,消化時應注意觀察細胞形態,如細胞變得橢圓透亮,并且可以觀察到細胞與細胞間的間隙時,輕拍瓶身可以看見成流沙狀,即可中止消化,消化時盡量減少對細胞的吹打。

(4)當細胞*分離時,垂直放置培養瓶,讓細胞流到培養瓶的底部。在培養瓶中加入*培養基中止消化,計數并再次培養細胞。

(5)對于無血清培養基,加入大豆抑制劑。通常使用1∶1(v∶v)0.25 mg/ml抑制劑到中將抑制活性。


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